前言

大腸桿菌素(coliins)是由大腸桿菌產(chǎn)生的抗菌蛋白質(zhì)。它通過物理損壞發(fā)揮細(xì)胞殺傷活性，這與大多數(shù)常規(guī)抗生素不同，大多數(shù)常規(guī)抗生素通過抑制蛋白質(zhì)合成(如卡那霉素)、細(xì)胞壁生物合成(如青霉素)和DNA復(fù)制/修復(fù)(如環(huán)丙沙星)來抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。而且，大腸桿菌素可能對(duì)人類沒有毒性，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞毒性只對(duì)產(chǎn)生受體蛋白如BtuB、Cir、FhuA和OmpF的細(xì)菌有效，而這些受體蛋白不存在于人類細(xì)胞中。由于其的細(xì)胞殺傷活性，被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的可行替代品。此外，大腸桿菌素存在多個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過將它們和其他細(xì)菌素結(jié)合，為設(shè)計(jì)新型的絞痛蛋白提供了靈活性。

因此，大腸桿菌素的進(jìn)一步工程可能提供具有新功能和結(jié)構(gòu)特性的新蛋白質(zhì)，可用于控制細(xì)菌感染。有研究證明大腸桿菌素或許有能力殺死被稱為持久存留細(xì)胞的非生長(zhǎng)細(xì)胞，這些細(xì)胞可以通過進(jìn)入代謝休眠狀態(tài)在抗生素治療下存活。然而，大腸桿菌素的重組生產(chǎn)需要共同生產(chǎn)免疫蛋白來保護(hù)宿主細(xì)胞;否則，大腸桿菌素對(duì)宿主細(xì)胞是致命的。

傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的合成方法受限于細(xì)胞生長(zhǎng)、維護(hù)、污染等因素，特別是一些難表達(dá)的毒性蛋白。為了突破這些限制以及為高效蛋白質(zhì)制備和研究提供更多選擇，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。與活細(xì)胞系統(tǒng)相比，CFPS是一個(gè)更靈活、可控的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，為研究人員提供了以下優(yōu)勢(shì)：

1.開放的反應(yīng)環(huán)境為新合成的蛋白質(zhì)帶來了以前沒有的控制水平和設(shè)計(jì)自由度;

2.通過使用PCR產(chǎn)生的線性DNA模板，無細(xì)胞系統(tǒng)可以省去耗時(shí)的克隆步驟;

3.無細(xì)胞系統(tǒng)可以在沒有細(xì)胞的情況下產(chǎn)生有毒蛋白質(zhì)。

今天小編和大家分享一篇發(fā)表在Synthetic Biology期刊上的文章“Rapid production and characterization of antimicrobialcolicins usingEscherichia coli-based cell-free protein synthesis(基于大腸桿菌的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法快速生產(chǎn)抗菌大腸桿菌素及其特性研究)"，旨在為大家介紹一種可以用于快速表達(dá)毒性蛋白的方法。

研究背景

無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(CFPS)是一個(gè)很有前途的靈活表達(dá)和篩選酶的平臺(tái)。CFPS已被用于構(gòu)建抗微生物肽庫，表征腸道菌素L50A和L50B，并鑒定Col E1質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的大腸桿菌素E1。CFPS還用于產(chǎn)生毒性蛋白質(zhì)，如癌癥治療癌酶。

在這項(xiàng)研究中，作者使用基于大腸桿菌的CFPS系統(tǒng)，用于大腸桿菌素的快速合成和表征。研究報(bào)道，大腸桿菌素E1和E2能有效地清除藥物持久存留細(xì)胞。進(jìn)一步證明了CFPS系統(tǒng)用于毒性蛋白質(zhì)合成和表征的可行性，并為開發(fā)大腸桿菌素作為下一代抗菌藥物提供了新的平臺(tái)。

結(jié)果

1.“無細(xì)胞"提取物的制備

細(xì)胞裂解物使用超聲處理法從大腸桿菌BL21(DE3) Star菌株的培養(yǎng)物中制備。通過注射器過濾的方法從提取物中去除在離體制備過程中通過離心未分離的活細(xì)胞。并使用這種過濾方法得到的“無細(xì)胞"提取物來合成大腸桿菌素。

2.CFPS合成大腸桿菌素

研究人員合成了具有不同功能的不同類型大腸桿菌素，包括肽聚糖生物合成抑制的大腸桿菌素M、成孔的腸絞痛素Ia和E1以及核酸酶大腸桿菌素E2 。CFPS不受細(xì)胞活力限制，使研究人員能夠在沒有免疫蛋白的情況下產(chǎn)生高滴度的大腸桿菌素，使用CFPS的可溶性大腸桿菌素的產(chǎn)量是體內(nèi)大腸桿菌素產(chǎn)量的10倍，通常約為24-28μg/ml。與耗時(shí)的克隆相比，研究選擇使用大腸桿菌素基因的線性DNA模板來更快地生產(chǎn)大腸桿菌素。通過增加PCR模板的量(與200 ng pCC1-cia質(zhì)粒相比，200 ng Ia基因PCR產(chǎn)物)將Ia產(chǎn)量提高到與質(zhì)粒模板Ia生產(chǎn)幾乎相似的水平。

圖1：無細(xì)胞大腸桿菌素合成

3.大腸桿菌素核酸酶E2通過不含免疫蛋白的CFPS合成

為了避免宿主細(xì)胞毒性，大腸桿菌素必須通過同源免疫蛋白與細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來阻斷。例如，大腸桿菌素E2作為DNA酶發(fā)揮作用，E2免疫蛋白在體內(nèi)同一操縱子中共同產(chǎn)生。在沒有E2免疫蛋白的情況下，研究人員使用CFPS產(chǎn)生了260±10μg/ml的E2(圖1A)。結(jié)果表明，在不存在免疫蛋白的情況下，可以使用CFPS生產(chǎn)核酸酶E2大腸桿菌素，而不考慮合成的大腸桿菌素E2對(duì)DNA模板的降解。

圖2：E2免疫蛋白對(duì)DNA降解和無細(xì)胞E2產(chǎn)生的影響

4.無細(xì)胞合成的大腸桿菌素在細(xì)胞殺傷中具有活性

作者研究了未經(jīng)純化的無細(xì)胞合成的大腸桿菌素的細(xì)胞殺傷活性。首先，使用不同濃度的大腸桿菌素E1進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)試，以確定其適合濃度。暴露于250 ng/ml或更高濃度的大腸桿菌素E1后，我們沒有檢測(cè)到任何存活細(xì)胞(圖3A)。先前有報(bào)道稱，大腸桿菌素在1分鐘內(nèi)迅速使99%以上的靶細(xì)胞失活。該研究觀察到無細(xì)胞合成的E1(750 ng/ml)僅暴露1分鐘就滅活了99.9%以上的細(xì)胞(圖3B)，證實(shí)了之前的研究，并且用E1處理的細(xì)胞培養(yǎng)物沒有顯示生長(zhǎng)。而未經(jīng)大腸桿菌素的培養(yǎng)物的細(xì)胞群(圖3B)和濁度(圖3C)增加。除了大腸桿菌素E1活性外，我們還觀察到在LB培養(yǎng)基中暴露于大腸桿菌素Ia和E2的樣品中的大量細(xì)胞死亡(圖3D)。這些結(jié)果表明，未經(jīng)純化的無細(xì)胞合成大腸桿菌素是具有活性的，并在富培養(yǎng)基中快速滅活細(xì)胞。

圖3：無細(xì)胞合成絞痛蛋白的活性(將K361細(xì)胞暴露于無細(xì)胞合成的大腸桿菌素，未添加大腸桿菌素質(zhì)粒作為對(duì)照組(No.Col)

5.大腸桿菌素在營養(yǎng)豐富和無營養(yǎng)條件下的活性比較

由于大腸桿菌素細(xì)胞殺傷機(jī)制會(huì)物理損傷靶細(xì)胞的內(nèi)膜或切割核酸，研究評(píng)估了大腸桿菌素在非生長(zhǎng)、無營養(yǎng)條件下對(duì)細(xì)胞的活性，以確定大腸桿菌素是否能提供優(yōu)于抗生素的優(yōu)勢(shì)，其中大多數(shù)抗生素只能殺死生長(zhǎng)中的細(xì)胞。研究結(jié)果證實(shí)，大腸桿菌素的細(xì)胞毒性取決于靶細(xì)胞的代謝狀態(tài)，很可能是因?yàn)閿z取需要能量。不同類型的腸絞痛蛋白的細(xì)胞殺傷活性可能不同，如果營養(yǎng)供應(yīng)不能充分激發(fā)靶細(xì)胞，則可能降低細(xì)胞殺傷活性(圖3D、3E)。

6.不同濃度大腸桿菌素的細(xì)胞毒性比較

為了比較無細(xì)胞合成的絞痛蛋白之間的細(xì)胞毒性，我們?cè)u(píng)估了不同濃度大腸桿菌素處理后的細(xì)胞活力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在本研究其他地方使用的大腸桿菌素濃度(750 ng/ml)在很大細(xì)胞毒性范圍內(nèi)，大腸桿菌素E1和E2具有高細(xì)胞毒性，但I(xiàn)a沒有。此外，研究還證實(shí)了無細(xì)胞合成的大腸桿菌素E1的細(xì)胞毒性與體內(nèi)產(chǎn)生的大腸桿菌素相當(dāng)(圖4A、4B)。

圖4：不同濃度大腸桿菌素的細(xì)胞殺傷活性

7.大腸桿菌素E1和E2殺死持久存留細(xì)胞

由于腸絞痛蛋白E1和E2在0.85%NaCl和LB中殺死細(xì)胞(圖3D和E)，我們推斷這些腸絞痛蛋白可能有效殺死持久細(xì)胞，持久存留細(xì)胞是在應(yīng)激條件下形成的休眠、非代謝細(xì)胞群。由于持久存留細(xì)胞不生長(zhǎng)，即使沒有獲得耐藥性機(jī)制，它們對(duì)高濃度的抗生素也不敏感。研究結(jié)果表明大腸桿菌素可以以不同的持續(xù)狀態(tài)穿透靶細(xì)胞，并物理損傷內(nèi)膜(通過E1)或降解DNA(通過E2)，這是抗生素?zé)o法實(shí)現(xiàn)的。大腸桿菌素的細(xì)胞殺傷活性可能使我們開發(fā)出控制不生長(zhǎng)的持久存留細(xì)胞的新策略(圖5)。

圖5：大腸桿菌素除去持久存留細(xì)胞

總結(jié)

研究發(fā)現(xiàn)使用CFPS可以產(chǎn)生抗菌大腸桿菌素，并且無細(xì)胞合成的大腸桿菌素可以在不純化的情況下有效殺死靶細(xì)胞。CFPS能夠從線性DNA模板快速生產(chǎn)和表征大腸桿菌素，而不需要共同生產(chǎn)免疫蛋白。研究還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌素E1和E2在無營養(yǎng)條件下表現(xiàn)出細(xì)胞殺傷作用，并除掉持久存留細(xì)胞。為利用大腸桿菌素作為強(qiáng)大的新工具來解決日益嚴(yán)重的抗菌耐藥性問題提供了機(jī)會(huì)。此外，本研究進(jìn)一步證明了CFPS在生產(chǎn)有毒蛋白質(zhì)方面的優(yōu)勢(shì)，并擴(kuò)展了CFPS平臺(tái)在高通量蛋白質(zhì)合成和表征中的應(yīng)用。