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技術(shù)突破：珀羅汀實(shí)現(xiàn)無細(xì)胞蛋白表達(dá)結(jié)合納米盤超高效率表達(dá)全長膜蛋白

更新時(shí)間：2024-11-22 點(diǎn)擊次數(shù)：437

珀羅汀生物膜蛋白表達(dá)平臺(tái)取得新突破！

日前，珀羅汀生物通過在自主研發(fā)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）系統(tǒng)中添加納米盤（Nanodisc），實(shí)現(xiàn)膜蛋白表達(dá)后高效率地直接組裝在納米盤中！

珀羅汀擁有全部自主知識(shí)產(chǎn)品！

預(yù)計(jì)此項(xiàng)技術(shù)將大大提升國內(nèi)膜蛋白研究、研發(fā)的整體效率！

膜蛋白表達(dá)新選擇

膜蛋白在細(xì)胞的許多生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，例如物質(zhì)跨膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于膜蛋白存在疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），重組膜蛋白表達(dá)往往存在表達(dá)量低、構(gòu)象不穩(wěn)定的難點(diǎn)。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）是一種體外直接合成蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)。該技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機(jī)器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒有活細(xì)胞參與的體外合成蛋白質(zhì)。

CFPS可控性、開放性高，可以在體系中直接添加去垢劑或納米盤，為膜蛋白提供類膜環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)全長膜蛋白可溶性表達(dá)。

圖1 無細(xì)胞體系表達(dá)膜蛋白^[1]

無細(xì)胞表達(dá)偶聯(lián)納米盤組裝新突破

近日，珀羅汀生物在自研無細(xì)胞體系中加入Nanodisc，成功表達(dá)了某融合綠色熒光蛋白（GFP）的膜蛋白，并驗(yàn)證了該膜蛋白成功組裝進(jìn)納米盤。如圖2所示，該膜蛋白在無去垢劑與納米盤的CFPS體系中沉淀表達(dá)，而添加表面活性劑或納米盤后均可實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)，且添加納米盤時(shí)表達(dá)情況優(yōu)于去垢劑組。

圖2 CFPS+Nanodisc表達(dá)情況

本實(shí)驗(yàn)所用膜支架蛋白（MSP）帶有His純化標(biāo)簽，而融合GFP的膜蛋白無His純化標(biāo)簽。如圖3所示，經(jīng)鎳珠親和純化后，膠圖有明顯目標(biāo)膜蛋白條帶，表明通過MSP的His標(biāo)簽純化到了目標(biāo)膜蛋白，即目標(biāo)膜蛋白成功組裝在納米盤中！

圖3 CFPS+Nanodisc組裝情況

膜蛋白的“搖籃"

納米盤（Nanodisc）是由膜支架蛋白（MSP）和磷脂分子組成的圓盤狀類膜結(jié)構(gòu)，能夠?yàn)槟さ鞍滋峁┓€(wěn)定、接近天然的膜環(huán)境。

圖4 Nanodisc結(jié)構(gòu)示意圖^[2]

Nanodisc體系的顯著優(yōu)勢在于：

①Nanodisc能夠提供與天然細(xì)胞膜更接近的磷脂雙分子層環(huán)境，有利于膜蛋白形成正確的天然構(gòu)象；

②Nanodisc更有利于維持膜蛋白構(gòu)象穩(wěn)定，有利于下游純化；

③組裝在Nanodisc中的膜蛋白更有利于下游研究，可直接進(jìn)行ELISA檢測，可應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)，適用于NMR、EPR等各種技術(shù)；

④通過靈活使用不同長度的膜支架蛋白，Nanodisc可以適應(yīng)不同尺寸的膜蛋白。

無細(xì)胞體系允許膜蛋白表達(dá)與組裝進(jìn)Nanodisc同時(shí)進(jìn)行。珀羅汀生物通過在無細(xì)胞體系中直接加入Nanodisc，已實(shí)現(xiàn)表達(dá)出的膜蛋白直接組裝在納米盤中。與基于細(xì)胞系統(tǒng)的Nanodisc平臺(tái)相比，無細(xì)胞表達(dá)偶聯(lián)Nanodisc組裝的方案避免了在表達(dá)后用去垢劑溶解膜蛋白的額外流程，減少了對(duì)膜蛋白構(gòu)象的影響，大大降低了膜蛋白純化難度。

從此，對(duì)于中國生命科學(xué)研究者而言，膜蛋白表達(dá)不再被卡脖子！

參考文獻(xiàn)

[1] Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023 Jul;48(7):642-654. doi: 10.1016/j.tibs.2023.03.006. Epub 2023 Apr 20. PMID: 37087310.

[2] Gulezian E, Crivello C, Bednenko J, Zafra C, Zhang Y, Colussi P, Hussain S. Membrane protein production and formulation for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 2021 Aug;42(8):657-674. doi: 10.1016/j.tips.2021.05.006. PMID: 34270922.