“一鍵合成”｜從DNA到膜蛋白

更新時(shí)間：2024-12-06 點(diǎn)擊次數(shù)：1273

膜蛋白在細(xì)胞表面的特定位置具有特定功能，其在生理功能（比如說營養(yǎng)吸收、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、有毒物質(zhì)的去除等等）和病理過程（如癌癥發(fā)展、病原體入侵等等）中發(fā)揮著重要作用，也是理想的藥物靶點(diǎn)。膜蛋白表達(dá)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極其重要的地位，但同時(shí)也面臨著諸多挑戰(zhàn)和瓶頸。

一、膜蛋白表達(dá)的重要性及瓶頸

1. 重要性

1.1物質(zhì)運(yùn)輸與信號(hào)傳導(dǎo)：膜蛋白作為細(xì)胞膜的主要成分，負(fù)責(zé)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的傳導(dǎo)。

1.2細(xì)胞識(shí)別與免疫應(yīng)答：膜蛋白還參與細(xì)胞的識(shí)別過程，作為細(xì)胞表面的標(biāo)志物，能夠與其他細(xì)胞或分子相互作用。

1.3藥物靶點(diǎn)與疾病治療：膜蛋白承擔(dān)了生物膜的主要功能,是新藥研發(fā)最重要的靶點(diǎn)群,大約60%的藥物以膜蛋白為靶點(diǎn)。

2.瓶頸

2.1表達(dá)效率低：由于膜蛋白復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和疏水性，使得它們在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)往往受多種因素的限制，從而導(dǎo)致表達(dá)效率低下。

2.2純化困難：膜蛋白與細(xì)胞膜緊密結(jié)合，難以通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法獲得高純度的目標(biāo)蛋白。

2.3穩(wěn)定性差：由于膜蛋白在水溶液中有明顯的聚集和變性傾向,在體外很難模擬維持膜蛋白正確構(gòu)象的類膜環(huán)境,導(dǎo)致膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及相關(guān)配體藥物的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于水溶性蛋白。

2.4功能驗(yàn)證困難：由于膜蛋白的功能往往與其在細(xì)胞膜上的定位和相互作用密切相關(guān)，傳統(tǒng)的驗(yàn)證手段很難在體外準(zhǔn)確地驗(yàn)證其功能。

圖1.膜蛋白在生物體內(nèi)合成途徑

綜上所述，膜蛋白表達(dá)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有不可替代的作用，但同時(shí)也面臨著諸多挑戰(zhàn)和瓶頸。為了克服這些困難，研究者們正在不斷探索新的表達(dá)系統(tǒng)和純化方法，以期提高膜蛋白的表達(dá)效率和純度，為疾病治療和藥物研發(fā)提供更有力的支持。其中，無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（Cell-Free Protein Synthesis, CFPS）因其優(yōu)勢，在膜蛋白表達(dá)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。

二、CFPS技術(shù)在膜蛋白表達(dá)上的應(yīng)用

2.1 概述

CFPS技術(shù)是一種在體外實(shí)現(xiàn)DNA到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯過程的技術(shù)。它利用來源于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯元件，在體外構(gòu)建能夠直接從DNA合成蛋白質(zhì)的反應(yīng)體系。這種技術(shù)擺脫了細(xì)胞的束縛，具有快速、靈活、可控和易于優(yōu)化的特點(diǎn)。

在膜蛋白表達(dá)中，CFPS技術(shù)能夠顯著提高表達(dá)效率，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和添加特殊配置的輔助分子試劑，實(shí)現(xiàn)膜蛋白的高效合成。同時(shí)，由于無細(xì)胞體系不含有復(fù)雜的細(xì)胞成分，因此可以簡化膜蛋白的純化過程，提高純度和回收率。此外，無細(xì)胞體系還能夠提供適宜的反應(yīng)條件，如溫度、pH值和離子強(qiáng)度等，有助于維持膜蛋白的天然構(gòu)象和穩(wěn)定性。更重要的是，CFPS技術(shù)為膜蛋白的功能驗(yàn)證提供了有力支持。通過構(gòu)建細(xì)胞膜模型，利用脂質(zhì)體或合成細(xì)胞膜模擬細(xì)胞膜環(huán)境，研究者可以在體外觀察膜蛋白的活性、轉(zhuǎn)運(yùn)速率和信號(hào)傳導(dǎo)能力等，從而驗(yàn)證其功能。這種方法不僅避免了細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的干擾，還提高了功能驗(yàn)證的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.2 應(yīng)用場景

生產(chǎn)嗅覺受體蛋白

嗅覺受體蛋白是一類典型的膜蛋白,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，可以直接識(shí)別氣味分子,將生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最終傳遞至神經(jīng)中樞，調(diào)控著生物的食物尋找、危險(xiǎn)趨避和求偶行為。但是傳統(tǒng)的膜蛋白獲取方法并不容易。天然組織中的膜蛋白含量太低不足以支撐學(xué)術(shù)研究。李劍勇等人選取Canton-S果蠅的嗅覺受體蛋白OR83b、OR7a和OR42a作為研究對象，探索用于膜蛋白表達(dá)的無細(xì)胞表達(dá)體系.成功表達(dá)出嗅覺受體蛋白質(zhì)OR83b、OR7a和OR42a，最高表達(dá)量達(dá)到313 mg/L，實(shí)現(xiàn)了膜蛋白的高效表達(dá)。

圖2：OR83b和OR42a的可溶性表達(dá)

制備病毒體

siRNA治療應(yīng)用的困難在于缺乏安全有效的輸送載體，而病毒體作為一種由脂質(zhì)膜和膜蛋白組成的納米囊泡，它保留了沒病毒遺傳物質(zhì)的融合蛋白，因此與病毒載體相比，免疫原性較低。然而傳統(tǒng)的病毒體制備過程很繁瑣，涉及洗滌劑溶解病毒膜蛋白，離心去除病毒核酸，最后進(jìn)行脂質(zhì)自組裝。此外，使用洗滌劑可能會(huì)破壞膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能完整性，且脂質(zhì)體自組裝過程無法確保藥物的有效封裝。Wang Y等人使用CFPS技術(shù)，在體外合成HA2蛋白，且在一步反應(yīng)中制備HA2病毒體，并成功實(shí)現(xiàn)了siRNA的輸送。與Leci脂質(zhì)體相比，HA2病毒體表現(xiàn)出更高的siRNA輸送效率和VEGF基因沉默效率。

圖3：病毒體的表達(dá)及運(yùn)輸

上述應(yīng)用場景只是CFPS技術(shù)在膜蛋白表達(dá)領(lǐng)域的冰山一角，它通過優(yōu)化表達(dá)條件、簡化純化過程和提高穩(wěn)定性，為解決膜蛋白表達(dá)和純化過程中的瓶頸問題提供了新的途徑。為膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究、功能驗(yàn)證和藥物研發(fā)提供了有力支持。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，CFPS技術(shù)有望在膜蛋白表達(dá)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，為生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)做出更大的貢獻(xiàn)。

珀羅汀生物依托自主研發(fā)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)平臺(tái)，已成功實(shí)現(xiàn)對膜蛋白的高效快速合成，成為膜蛋白表達(dá)的救星。

參考文獻(xiàn)

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