無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)（Cell-free protein synthesis）是指將細(xì)胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機(jī)器提取出來(lái)，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒(méi)有活細(xì)胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)的生物合成反應(yīng)。無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)的技術(shù)原理是中心法則，是轉(zhuǎn)錄和翻譯的體外進(jìn)行。即在無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的反應(yīng)體系中，目的蛋白的DNA 模板在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄出mRNA ，隨后在氨酰-tRNA合成酶、核糖體以及tRNA的作用下，以mRNA為模板翻譯出目的蛋白。

一是反應(yīng)周期短，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)省去了傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)等步驟，可以在幾小時(shí)到一天內(nèi)表達(dá)蛋白。以蘇州珀羅汀（PLD technology）的無(wú)細(xì)胞試劑盒為例，最快可以1小時(shí)產(chǎn)出蛋白，適合進(jìn)行蛋白快速交付。

二是可以與自動(dòng)化設(shè)備結(jié)合，在多孔板（如96孔板），進(jìn)行自動(dòng)化高通量蛋白表達(dá)，短時(shí)間內(nèi)高通量蛋白篩選的需求，適合酶定向進(jìn)化篩選、AI蛋白制造等領(lǐng)域。

三是可表達(dá)蛋白種類多。有些蛋白在傳統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低甚至不能表達(dá)，而無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)可以擺脫細(xì)胞自身生理功能限制，廣泛適用于細(xì)胞因子、抗體、膜蛋白、毒性蛋白、包涵體蛋白表達(dá)等場(chǎng)景。

四是自由度與可控程度高，可以引入非天然氨基酸，實(shí)現(xiàn)特定位置修飾，適合ADC藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。此外，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)相較于傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)流程更短、操作更簡(jiǎn)便。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)能解決傳統(tǒng)蛋白表達(dá)流程長(zhǎng)、耗時(shí)久、膜蛋白與毒蛋白等難表達(dá)的痛點(diǎn)與難點(diǎn)。無(wú)細(xì)胞體系可以表達(dá)膜蛋白，目前國(guó)內(nèi)的珀羅汀生物有適合膜蛋白的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒，只要按照說(shuō)明書(shū)將膜蛋白的DNA模板，合適的表面活性劑或納米盤(pán)等，加到表達(dá)試劑中，幾小時(shí)到一天就能得到膜蛋白。

珀羅汀無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以通過(guò)控制反應(yīng)溫度、添加分子伴侶、輔助因子等，幫助形成正確的蛋白折疊，合成的蛋白具有與細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相當(dāng)甚至更好的活性。與常規(guī)的細(xì)胞表達(dá)一樣，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物除目標(biāo)蛋白之外還有其他蛋白殘留。對(duì)于抗體親和性和酶活性的檢測(cè)，無(wú)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物可以無(wú)需純化直接測(cè)試；對(duì)于有蛋白純度要求或需要進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的項(xiàng)目，按照相應(yīng)蛋白常規(guī)表達(dá)后的純化流程操作即可。

無(wú)細(xì)胞技術(shù)可以表達(dá)二硫鍵蛋白，但具體視廠商的產(chǎn)品而異。珀羅汀生物推出的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)品均支持表達(dá)二硫鍵蛋白。原核生物來(lái)源的無(wú)細(xì)胞體系無(wú)糖基化修飾，真核生物來(lái)源的無(wú)細(xì)胞體系具有有限的糖基化修飾。

 Q6：無(wú)細(xì)胞體系的效能如何？可以放大到什么規(guī)模？

無(wú)細(xì)胞體系的效能一般與目標(biāo)蛋白有關(guān)，表達(dá)量從μg/mL到數(shù)百μg/mL不等。以珀羅汀生物無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒為例，蛋白表達(dá)量最高可以達(dá)到3 mg/mL。無(wú)細(xì)胞體系可以放大，已有進(jìn)行百升級(jí)規(guī)模化生產(chǎn)的報(bào)道。

線性模板、質(zhì)粒模板都可以。但是線性模板要在目的基因兩端各引入一段特定序列，以在目的基因兩側(cè)引入轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的因子。PLD無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒會(huì)提供質(zhì)粒載體，將目的基因重組到質(zhì)粒載體上，表達(dá)效果往往優(yōu)于線性模板。無(wú)細(xì)胞試劑盒一般對(duì)DNA模板在反應(yīng)體系中的濃度有要求，要根據(jù)具體要求與反應(yīng)規(guī)模確定模板的用量。