今天小編和大家分享一篇中國(guó)-第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院發(fā)表在Nature Communications上的一項(xiàng)突破性成果——TRACKer（Target-Responsive non-preAmplification Cell-free diagnostic Kit），一種低成本、可擴(kuò)展的解決方案。研究團(tuán)隊(duì)?wèi){借CFPS（無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)）技術(shù)將整個(gè)檢測(cè)流程壓縮至70分鐘（CFPS試劑盒來(lái)自蘇州珀羅汀生物技術(shù)有限公司）。

呼吸道病毒無(wú)處不在，是人類社會(huì)中最常見(jiàn)、傳播廣的傳染病之一。當(dāng)前呼吸道病毒核酸檢測(cè)技術(shù)，難以同時(shí)滿足精準(zhǔn)定量與快速篩查的雙重需求，核心痛點(diǎn)包括：

1. 依賴預(yù)擴(kuò)增，流程繁瑣：RT-qPCR、LAMP 等技術(shù)需先擴(kuò)增靶標(biāo)核酸，不僅耗時(shí)，還容易造成污染，且需專業(yè)實(shí)驗(yàn)室與溫控設(shè)備，基層與現(xiàn)場(chǎng)難以開(kāi)展。

2. 通用性差，設(shè)計(jì)成本高：主流無(wú)細(xì)胞核糖調(diào)節(jié)器（如 toehold 開(kāi)關(guān)）需針對(duì)每種病原體重新建模、反復(fù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)、擴(kuò)展性差，無(wú)法快速適配多種病毒檢測(cè)。

3. 靈敏度與便攜性難兼得：快速抗原檢測(cè)雖然便攜但靈敏度低；高靈敏度核酸檢測(cè)又離不開(kāi)大型儀器，難以實(shí)現(xiàn) “即時(shí)、精準(zhǔn)" 檢測(cè)。

TRACKer是基于從頭設(shè)計(jì)核酶調(diào)控的無(wú)細(xì)胞診斷平臺(tái)，其在同一檢測(cè)體系中結(jié)合了核酶切換與互補(bǔ)鏈置換技術(shù)（圖1）。得益于CFPS（無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)）技術(shù)，無(wú)需預(yù)擴(kuò)增即可達(dá)到Attomolar級(jí)別的靈敏度。此外，研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)6 種常見(jiàn)呼吸道病毒，系統(tǒng)驗(yàn)證了 TRACKer 性能。

• 核酶變構(gòu)模塊：基于 HH15 核酶設(shè)計(jì)，通過(guò)鏈置換介導(dǎo)核酶構(gòu)象切換，實(shí)現(xiàn)通用靶標(biāo)識(shí)別。無(wú)靶標(biāo)時(shí)，IRS 鏈結(jié)合核酶抑制其活性；靶標(biāo) RNA 存在時(shí)，靶標(biāo)與 IRS 特異性結(jié)合，置換 IRS 并激活核酶。

  
  

• 核糖調(diào)節(jié)器激活模塊：激活的核酶切割底物，暴露核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），啟動(dòng)CFPS體系中報(bào)告蛋白級(jí)聯(lián)表達(dá)，將單個(gè)靶標(biāo)識(shí)別事件放大為大量報(bào)告分子，實(shí)現(xiàn)無(wú)預(yù)擴(kuò)增高靈敏度檢測(cè)。

  
  

• 輸出模塊：支持雙模式信號(hào)輸出，實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)景用 HiBiT 發(fā)光報(bào)告（精準(zhǔn)定量），現(xiàn)場(chǎng)場(chǎng)景用 Flag-His 雙標(biāo)簽肽（側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l可視化），無(wú)需儀器即可肉眼判讀。

1. 樣本處理：提取臨床咽拭子樣本病毒 RNA（15 分鐘）；

2. 靶標(biāo)識(shí)別：RNA 與 TRACKer 探針31℃孵育，靶標(biāo)激活核酶（20 分鐘）；

3. 信號(hào)放大：加入CFPS體系，25℃啟動(dòng)報(bào)告蛋白合成（40 分鐘）；

4. 信號(hào)讀?。簩?shí)驗(yàn)室測(cè)發(fā)光值，現(xiàn)場(chǎng)用側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l肉眼判讀（5 分鐘）。

研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)6 種常見(jiàn)呼吸道病毒（甲流 FluA、乙流 FluB、呼吸道合胞病毒 RSV、人鼻病毒 HrV、副流感病毒 HPIV、新冠 SARS-CoV-2）系統(tǒng)驗(yàn)證 TRACKer 性能，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)前沿水平。

• 靈敏度：通過(guò)將CFPS合成的級(jí)聯(lián)放大技術(shù)與HiBiT輸出模式相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度檢測(cè)，對(duì) 6 種病毒的檢測(cè)限（LOD）低至1-10 阿摩爾（aM），可直接檢測(cè)微量病毒 RNA，無(wú)需預(yù)擴(kuò)增，靈敏度比快速抗原檢測(cè)高且與 RT-qPCR 相當(dāng)。

• 特異性：僅識(shí)別對(duì)應(yīng)靶標(biāo) RNA，非靶向病毒RNA產(chǎn)生的信號(hào)始終維持在與陰性對(duì)照相當(dāng)?shù)幕€水平；單個(gè)堿基錯(cuò)配即可顯著降低信號(hào)，末端錯(cuò)配抑制效果更強(qiáng)，可精準(zhǔn)區(qū)分病毒亞型與突變株。

• 正交性：6 種病毒特異性 TRACKer 系統(tǒng)互不干擾，無(wú)交叉激活，支持多病毒聯(lián)合檢測(cè)，適合呼吸道感染綜合征篩查。

研究團(tuán)隊(duì)用188 例臨床咽拭子樣本（FluA 56例、RSV 42 例、HrV 90 例）驗(yàn)證 TRACKer 臨床性能（圖4），TRACKer所依賴的CFPS系統(tǒng)展現(xiàn)了出色的可靠性與一致性。

• FluA：靈敏度 100%，特異性 94.8%；

• HrV：靈敏度 90%，特異性 92%；

• RSV：靈敏度 88.9%，特異性 96.4%。

與細(xì)胞內(nèi)翻譯相比，CFPS系統(tǒng)省去了將DNA遞送入細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄等前置步驟，也避免了細(xì)胞膜的通透性屏障。反應(yīng)組分預(yù)先混合好，靶標(biāo)RNA的加入直接觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，翻譯機(jī)器幾乎立即開(kāi)始工作。